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　　5月2日，陸道培醫(yī)院陸佩華教授(第一作者和共同通訊作者)團(tuán)隊(duì)、河北森朗生物科技有限公司(以下簡(jiǎn)稱(chēng)"森朗")李建強(qiáng)教授(共同通訊作者)團(tuán)隊(duì)(劉瑩，共同第一作者)、北京大學(xué)人民醫(yī)院黃曉軍教授(共同通訊作者)合作在血液科國(guó)際權(quán)威期刊Blood(IF=23.63)發(fā)表了題為Naturally Selected CD7 CAR-T Therapy without Genetic Manipulations for T-ALL/LBL: First-in-human Phase I Clinical Trial 的研究論文。

　　急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL) 和T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤(T-cell lymphoblastic lymphoma, T-LBL)是具有高度侵襲性的T系惡性腫瘤。由于正常T細(xì)胞和惡性T細(xì)胞之間共有的抗原性，目前仍然缺乏針對(duì)T細(xì)胞惡性腫瘤的獲批CAR-T療法。

　　CD7在T-ALL/LBL T細(xì)胞表面高度表達(dá)，是潛在的CAR-T治療靶點(diǎn)。靶向CD7的免疫療法可能會(huì)受到T細(xì)胞自相殘殺機(jī)制(fratricide)的影響。因此，在既往研究中曾采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和蛋白沉默表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)靶向CD7的CAR-T細(xì)胞。但是，基因編輯技術(shù)會(huì)使得CD7 CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)成本增加。此外，使用患者自體T細(xì)胞制造CD7 CAR-T細(xì)胞仍然具有一定難度。雖然供者來(lái)源或通用型CD7 CAR-T是一種選擇，但尋找合適的供體、異體CAR-T在體內(nèi)擴(kuò)增能力及持續(xù)時(shí)間等問(wèn)題仍有待解決。

　　針對(duì)上述難題，本研究開(kāi)展探索，使用了森朗生物研發(fā)的患者或供者來(lái)源的，無(wú)需額外進(jìn)行CD7基因編輯或蛋白質(zhì)表達(dá)阻斷的"自然選擇(Naturally Selected)"CD7 CAR-T細(xì)胞(NS7CAR)的新產(chǎn)品，并在1項(xiàng)針對(duì)T-ALL/LBL患者的1期臨床試驗(yàn)中首次探索了NS7CAR療法在人體內(nèi)的安全性和有效性。

　　臨床前研究

　　研究者使用三種不同的方法制造了靶向CD7的CAR-T細(xì)胞并比較它們的功能：1)NS7CAR：通過(guò)用7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)總T細(xì)胞，然后對(duì)其進(jìn)行"自然選擇"的細(xì)胞培養(yǎng)方式獲得;2)Neg7CAR：由天然存在的CD7陰性T細(xì)胞(占CD3+T細(xì)胞的3%-10%)用7CAR進(jìn)行純化和轉(zhuǎn)導(dǎo)后進(jìn)行生產(chǎn);3)KO7CAR：通過(guò)將7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)到使用CRISPR/Cas9RNP敲除CD7基因的總T細(xì)胞進(jìn)行制造。

　　在2周的培養(yǎng)期間內(nèi)，NS7CAR的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)顯著低于Neg7CAR和KO7CAR的擴(kuò)增倍數(shù);然而，有87.3%的NS7CAR是活細(xì)胞，使得進(jìn)一步研究成為可能。在收獲時(shí)，NS7CAR組中平均92.4%的T細(xì)胞表達(dá)7CAR分子，顯著高于Neg7CAR或KO7CAR(p<0.0001)。在7CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)三天后，NS7CAR組中的T細(xì)胞發(fā)生了從CD7+CAR-到CD7-CAR+的快速而顯著的表型轉(zhuǎn)變。

　　一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，盡管NS7CAR組中的T細(xì)胞在體外培養(yǎng)后用流式未檢測(cè)到CD7的表面表達(dá)，但使用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)到了顯著的CD7mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。與此同時(shí)，在Neg7CAR或KO7CAR細(xì)胞中未觀(guān)察到CD7mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)。這些結(jié)果表明，盡管NS7CAR表達(dá)CD7mRNA和蛋白質(zhì)，但它們?cè)诿庖邔W(xué)上是CD7陰性的，并由于CD7CAR的抗原隱蔽/細(xì)胞內(nèi)隔離作用而逃脫了自相殘殺的細(xì)胞殺傷機(jī)制。這一點(diǎn)在隨后的臨床研究中，在CAR-T回輸后第28天檢測(cè)到患者體內(nèi)NS7CAR中CD7mRNA的表達(dá)持續(xù)存在而被進(jìn)一步證實(shí)。此外，相比Neg7CAR和KO7CAR，NS7CAR包含較多的CD8+亞群和中央記憶表型亞群。

　　在體外抗白血病實(shí)驗(yàn)中，NS7CAR和KO7CAR對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞均表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，并釋放高水平的IFN-γ和TNF-α，但Neg7CAR細(xì)胞的相應(yīng)數(shù)值較低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在CAR-T注射后的前兩周內(nèi)，NS7CAR和KO7CAR均可顯著降低小鼠模型中的白血病負(fù)擔(dān)。這些數(shù)據(jù)證明了無(wú)需額外的基因編輯，直接由7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的總T細(xì)胞產(chǎn)生有效的CD7CAR-T的可行性。因此，陸道培醫(yī)療團(tuán)隊(duì)在1期臨床試驗(yàn)中使用NS7CAR-T細(xì)胞，進(jìn)一步探索其有效性和安全性�！　�

　　臨床研究

　　‖研究設(shè)計(jì)

　　本研究是1項(xiàng)開(kāi)放、單臂的1期臨床研究，目的是評(píng)估NS7CAR對(duì)CD7+R/R T-ALL或T-LBL患者的安全性和療效。入組標(biāo)準(zhǔn)包括年齡在2至65歲之間的患者，既往至少接受過(guò)兩線(xiàn)治療后失敗，且CD7表達(dá)≥80%的患者。在NS7CAR輸注后的第28天后，根據(jù)醫(yī)生的考量和患者的意愿，允許進(jìn)行鞏固性異體造血干細(xì)胞移植。

　　‖患者基線(xiàn)數(shù)據(jù)

　　此次臨床試驗(yàn)，共入組和回輸20名復(fù)發(fā)或難治性(R/R) T-ALL/T-LBL患者，其中包含14名R/R T-ALL患者及6名R/R T-LBL患者。3名患者為Ph陽(yáng)性或ETP-ALL高危亞型;11名患者存在高危突變或基因融合。5名患者在入組前接受過(guò)移植。患者接受了中位數(shù)為4.5線(xiàn)的治療。入組時(shí)，17名患者的骨髓腫瘤細(xì)胞比例中位數(shù)為21.49%;有3名T-LBL患者髓內(nèi)未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞。分別有5位T-LBL和4位T-ALL患者有髓外病灶，其中3名有中樞受累。

　　‖臨床產(chǎn)品制備及回輸

　　研究應(yīng)用了來(lái)源于患者或其移植供者的NS7CAR產(chǎn)品。對(duì)于未接受過(guò)異基因移植的患者，使用自體CAR-T細(xì)胞;對(duì)于入組時(shí)為移植后復(fù)發(fā)狀態(tài)的患者，在對(duì)患者進(jìn)行綜合評(píng)估后確定使用患者自體或移植供者來(lái)源的CAR-T細(xì)胞。所有患者的NS7CAR產(chǎn)品均成功制備(自體來(lái)源，n=18;供者來(lái)源，n=2)，中位轉(zhuǎn)染效率為95.10%。NS7CAR產(chǎn)品有更多的CD8+亞群，中位CD4/CD8比例為0.42。在Day0，分別3、16和1名患者接受了低劑量(0.5×106/kg)、中劑量(1-1.5×106/kg)或高劑量(2×106/kg)的單次NS7CAR回輸。

　　‖療效及安全性

　　NS7CAR展現(xiàn)出了良好的安全性和耐受性。1名患者未出現(xiàn)CRS;18名患者的CRS≤2級(jí)，僅有一名患者出現(xiàn)3級(jí)CRS。2名患者發(fā)生1級(jí)ICANS。

　　同時(shí)，NS7CAR在臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)了令人振奮的好療效。在Day28時(shí)，16/17(94.12%)的骨髓受累患者實(shí)現(xiàn)了MRD陰性完全緩解;3名僅有髓外病灶的T-LBL患者也繼續(xù)保持了髓內(nèi)CRi的狀態(tài)。在9名有髓外病灶的患者中，5名在中位時(shí)間29天時(shí)達(dá)到髓外CR。兩名有巨大縱隔腫物(>7cm)的患者在第29天分別達(dá)到髓外部分緩解(PR)和疾病穩(wěn)定(SD)，其中PR患者在第104天時(shí)，其髓外病灶進(jìn)一步縮小。兩名有中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的患者也分別在第15天和第28天達(dá)到CR。

　　至研究截止日期(2021年10月25日)，患者的中位隨訪(fǎng)時(shí)間為142.5天，最長(zhǎng)達(dá)311天。6/20名患者在CAR-T細(xì)胞回輸后未接受額外的抗白血病治療或移植，其中4人在54天的中位時(shí)間保持無(wú)疾病進(jìn)展。在回輸后中位時(shí)間57.5天，10名CR患者接受了鞏固性橋接移植;移植后中位隨訪(fǎng)時(shí)間為210天，7/10名CR患者在移植后保持MRD陰性并持續(xù)生存。兩名患者因個(gè)人原因出組，出組時(shí)均處于CR。一名患者進(jìn)行了二次移植，發(fā)展為3級(jí)aGvHD，隨后去世。有4名未達(dá)到CR或CR后復(fù)發(fā)的患者接受了挽救性移植并全部達(dá)到CR。　　

　　‖NS7CAR的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)

　　NS7CAR擴(kuò)增起始于回輸后中位數(shù)4.5天。CAR中位峰值拷貝數(shù)為1.37×105copies/μg DNA，達(dá)到峰值的中位時(shí)間為19天。在末次隨訪(fǎng)時(shí)，NS7CAR+DNA中位持續(xù)時(shí)間為90天;在移植后中位時(shí)間39.5天，12/14名患者仍可通過(guò)qPCR檢測(cè)到水平較低的NS7CAR+DNA。對(duì)于未橋接移植的6名患者，CAR-T細(xì)胞在末次隨訪(fǎng)中仍可檢測(cè)到，中位持續(xù)時(shí)間為48.5天。用流式檢測(cè)的NS7CAR中位峰值比例為67.76%，最高比例達(dá)84.71%;中位峰值時(shí)間為17天。

　　NS7CAR回輸后，患者外周血中惡性和正常CD7+細(xì)胞的最顯著減少發(fā)生在回輸后中位時(shí)間第7天。在CAR-T擴(kuò)增高峰，每位患者的T/B/NK細(xì)胞(不包括CAR+ 和白血病T細(xì)胞)的絕對(duì)數(shù)量均顯示出不同程度的短暫下降。NS7CAR迅速消滅了CD7+細(xì)胞，并主要保留了CD7陰性細(xì)胞亞群。T/B/NK細(xì)胞隨后恢復(fù)到基線(xiàn)水平，但就如所預(yù)期的，在移植后不久出現(xiàn)下降。在移植后，正常的CD7+T細(xì)胞和NK細(xì)胞得到充分恢復(fù)�！�

　　‖總結(jié)

　　該研究揭示了通過(guò)"自然選擇"機(jī)制生產(chǎn)靶向CD7 CAR-T細(xì)胞的方法(NS7CAR)。研究者發(fā)現(xiàn)，雖然流式無(wú)法檢測(cè)到NS7CAR-T細(xì)胞表面上的CD7分子，但NS7CAR-T細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)CD7mRNA和蛋白質(zhì)的水平雖然稍低，但與正常對(duì)照T細(xì)胞中的水平是可比的。研究認(rèn)為，NS7CAR-T細(xì)胞的CD7分子很可能被CD7CAR抗原掩蓋或在胞內(nèi)隔離，大大減少了NS7CAR-T的表面CD7抗原，避免了CAR-T細(xì)胞之間的大量自相殘殺。不能排除在體外"自然選擇"過(guò)程中，少部分NS7CAR-T細(xì)胞從自相殘殺中出現(xiàn)的可能性。這使得NS7CAR-T與真正的CD7陰性的Neg7CAR-T或KO7CAR-T細(xì)胞形成對(duì)比。研究者提出，許多NS7CAR-T細(xì)胞本身并不是CD7陰性，而是功能性CD7陰性。

　　因此，研究者提出假設(shè)：由于CAR信號(hào)可能需要蛋白質(zhì)復(fù)合物形成，CAR-T細(xì)胞通過(guò)NS7CAR-T細(xì)胞表面的游離CD7CAR與靶向T細(xì)胞上表達(dá)的CD7之間的相互作用被激活，而胞內(nèi)CD7-CD7CAR復(fù)合物不能激活T細(xì)胞。與Neg7CAR和KO7CAR細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)CD7CAR-CD7相互作用是否導(dǎo)致CAR信號(hào)減弱,并導(dǎo)致NS7CAR細(xì)胞體外擴(kuò)增程度降低仍待確定。其次，自相殘殺是否在NS7CAR減少擴(kuò)增中發(fā)揮了作用還有待進(jìn)一步研究。

　　在NS7CAR中，存在顯著更多的CD8+中央記憶CAR-T細(xì)胞，這種CD8偏向性可能提供更持久的疾病控制。由于NS7CAR的產(chǎn)生不涉及額外的基因編輯，避免了脫靶效應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，NS7CAR的生物學(xué)特性和其生產(chǎn)的便捷十分有利于其臨床應(yīng)用。

　　迄今為止，針對(duì)T細(xì)胞惡性血液腫瘤的靶向CD7 的CAR-T療法僅有有限的臨床試驗(yàn)和病例報(bào)告。NS7CAR可由患者或供者的外周血制備，中位轉(zhuǎn)染率大于95%，且細(xì)胞活性率約90%。由T系惡性血液腫瘤患者制備的自體CAR-T細(xì)胞的主要安全顧慮是細(xì)胞終產(chǎn)品中的惡性細(xì)胞污染。根據(jù)每個(gè)患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表型，使用CD3或CD4/CD8選擇加上NS7CAR的體外 "自然選擇 "以及強(qiáng)大的抗白血病活性，可以成功地排除NS7CAR制備中的惡性細(xì)胞。

　　在該臨床試驗(yàn)中，幾乎所有患者在第28天時(shí)都達(dá)到了MRD陰性的CR。大部分有髓外病灶的患者，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者或彌漫性髓外受累的患者，也都能達(dá)到髓外CR。兩名有巨大縱膈腫塊的患者分別達(dá)到了PR和SD。對(duì)于有巨大腫塊的患者來(lái)說(shuō)，可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間及聯(lián)合治療來(lái)實(shí)現(xiàn)CR，因?yàn)楦鶕?jù)PET-CT評(píng)估，處于PR的患者在第104天發(fā)現(xiàn)有進(jìn)一步的臨床改善。

　　入組該臨床試驗(yàn)的患者曾接受了大量的既往治療。鑒于CD19 CAR-T治療的B-ALL患者復(fù)發(fā)率較高，而且T-ALL/LBL比一般B-ALL更具侵略性，該研究允許在緩解后進(jìn)行鞏固性異基因造血干細(xì)胞移植。共有10名骨髓和髓外CR患者進(jìn)行了鞏固性異基因造血干細(xì)胞移植，這可能限制對(duì)于NS7CAR-T單藥治療的持續(xù)性的評(píng)估。盡管如此，在中位隨訪(fǎng)時(shí)間超過(guò)4.5個(gè)月(最長(zhǎng)10個(gè)月)的情況下，NS7CAR回輸后再進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植組沒(méi)有觀(guān)察到復(fù)發(fā)現(xiàn)象。在6名沒(méi)有接受移植的CR患者中，有4名在最后一次隨訪(fǎng)時(shí)仍保持CR(中位時(shí)間1.5個(gè)月，最長(zhǎng)6個(gè)月)。然而，在一些未達(dá)到CR或復(fù)發(fā)的患者中，觀(guān)察到CD7靶點(diǎn)丟失。

　　STIL-TAL1融合基因與較高的復(fù)發(fā)率和較差的預(yù)后有關(guān)，發(fā)生在高達(dá)約25%的T-ALL患者中。在這一研究中，所有3名STIL-TAL1融合基因的患者預(yù)后都較差，有1名NR和2名早期復(fù)發(fā)，表明單獨(dú)使用CAR-T療法可能無(wú)法扭轉(zhuǎn)其臨床結(jié)局。一旦這類(lèi)患者從CAR-T中獲得CR，應(yīng)在治療過(guò)程的早期考慮進(jìn)行移植。

　　NS7CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增在中位第19天達(dá)到峰值，截至最后一次隨訪(fǎng)時(shí)，可檢測(cè)到NS7CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在長(zhǎng)達(dá)195天。12/14名患者在移植后中位隨訪(fǎng)時(shí)間1.2個(gè)月(最長(zhǎng)4.9個(gè)月)時(shí)，仍可通過(guò)qPCR檢測(cè)到低水平的NS7CAR-T。

　　NS7CAR表現(xiàn)出卓越的安全性，在大多數(shù)患者中只有輕微的CRS，沒(méi)有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性。在該臨床研究方案中，早期應(yīng)用托珠單抗干預(yù)管理，有可能降低嚴(yán)重CRS的發(fā)生。這種早期干預(yù)和管理可能在減少CRS方面發(fā)揮了作用。

　　兩名曾有異基因造血干細(xì)胞移植史的患者在回輸時(shí)使用了來(lái)自移植供者的CAR-T細(xì)胞，其中一位出現(xiàn)了輕微的皮膚排異反應(yīng)。因此，應(yīng)特別關(guān)注此類(lèi)患者。14名患者中有7名接受了后續(xù)的異基因造血干細(xì)胞移植，包括其中2名第二次移植的患者出現(xiàn)了GvHD。雖然在這7名回輸后出現(xiàn)GvHD的患者中仍可檢測(cè)到極低水平的CAR-T細(xì)胞，但是不太可能是導(dǎo)致GvHD的原因。

　　小結(jié)

　　在該研究中，NS7CAR在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用。NS7CAR的首次人體臨床試驗(yàn)表明，無(wú)需額外的基因編輯即可防止CD7表達(dá)，并成功生產(chǎn)NS7CAR-T細(xì)胞�？傮w而言，NS7CAR對(duì)治療R/R T-ALL/LBL是安全且高效的。